La présentation des antigènes par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I est une étape déterminante de l'immunité adaptative : elle permet aux lymphocytes T cytotoxiques d'identifier les cellules infectées ou anormales. Pour être présentés efficacement, les peptides antigéniques doivent atteindre une longueur précise, de huit à dix résidus, afin de s'ajuster correctement dans le sillon de la molécule de CMH I. Dans le réticulum endoplasmique, ce calibrage repose sur l'action de deux aminopeptidases humaines, ERAP1 et ERAP2, qui retirent successivement des acides aminés à l'extrémité des peptides précurseurs. La compréhension fine de cette étape de découpage, et de sa régulation, est essentielle pour saisir comment se constitue le répertoire de peptides présenté à la surface cellulaire.
Si l'idée que les ERAP découpent des peptides libres est largement admise, des données issues d'expériences in vitro et cellulaires suggèrent que ces enzymes peuvent également agir sur des peptides liés, ou partiellement liés, aux molécules de CMH I — une configuration vraisemblablement plus proche de la situation physiologique. Pour explorer cette polyvalence, les auteurs décrivent un protocole expérimental complet permettant de suivre, pas à pas, le retrait des résidus par les ERAP. La méthode comporte d'abord la production de complexes recombinants solubles ERAP1/ERAP2 sous forme d'hétérodimères. Ces protéines sont exprimées en cellules d'insecte, les lignées Hi5 étant privilégiées car elles sécrètent davantage de protéine recombinante que les cellules Sf9, dans un milieu sans sérum dont l'absence de protéases favorise la stabilité des enzymes sécrétées. Les complexes ERAP sont ensuite immobilisés de façon covalente sur des billes de sépharose, ce qui facilite les immunoprécipitations en série et limite la contamination par les anticorps lors de la quantification.
Le test de découpage proprement dit consiste à incuber un peptide précurseur, sous forme libre ou lié au CMH I, avec les billes ERAP1/2 calibrées, puis à analyser les fragments générés par spectrométrie de masse. Un peptide témoin de quinze résidus sert à standardiser chaque nouveau lot de billes et à normaliser les résultats entre expériences. Les auteurs soulignent que les peptides libres sont découpés nettement plus rapidement que les peptides liés au CMH I, ce qui impose d'adapter les temps de prélèvement à l'objectif de chaque expérience. La préparation des molécules de CMH I déficientes en peptide, intrinsèquement instables et stabilisées par le glycérol, ainsi que le chargement contrôlé de peptides synthétiques de neuf résidus ou de précurseurs allongés à leur extrémité N-terminale, complètent le dispositif.
En permettant de suivre le découpage de peptides aussi bien libres que liés au CMH I, ce protocole offre un outil pour caractériser les événements de découpage et mieux cerner le rôle des ERAP dans la constitution du répertoire peptidique présenté aux lymphocytes T cytotoxiques.