Der Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AHR) ist ein ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor, der in menschlichen Zellen und Geweben breit exprimiert wird. Nach seiner Aktivierung wandert er in den Zellkern und lagert sich an das Protein ARNT an, wodurch ein Komplex entsteht, der eine spezifische DNA-Sequenz erkennt, das Xenobiotika-responsive Element (XRE), das in den Promotorregionen seiner Zielgene liegt, darunter Mitglieder der Cytochrom-P450-1-Familie wie CYP1A1. Der AHR ist am Metabolismus von Xenobiotika, an der Immunantwort sowie an der Zelldifferenzierung beteiligt und reguliert die Reaktion auf zahlreiche Umweltkontaminanten wie Dioxin oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe. Trotz der Bedeutung dieses Signalwegs stießen Studien auf das Fehlen einer robusten Methode zur raschen Beurteilung der transkriptionellen Aktivität des AHR: Die klassischen Luciferase-Assays erfordern nämlich die Lyse der Zellen.
Um diese Einschränkung zu überwinden, konstruierten die Autoren zwei neue Reportergene unter der Kontrolle von XRE-Elementen: einen fluoreszierenden Reporter, der das GFP-Protein mit dem Histon H2B verbindet (XRE-H2B-eGFP), und eine sezernierte Nanoluciferase (XRE-pNL1.3[secNluc]). Diese Werkzeuge wurden in mehreren Zelltypen validiert: primären humanen villösen Zytotrophoblasten sowie Zelllinien muriner embryonaler Fibroblasten NIH/3T3 und humaner Plazentazellen BeWo. Die Zellen wurden transfiziert und anschließend mit einem starken AHR-Liganden, Benzo[a]pyren (B[a]P), oder mit einem Inhibitor, CH223191, behandelt.
Im Vergleich zu den Kontrollzellen wurde nach Behandlung mit 0,5 und/oder 2 µM B[a]P eine signifikante Zunahme der AHR-Aktivität und nach Exposition gegenüber 3 µM CH223191 eine signifikante Abnahme beobachtet. Diese Reaktionen, gemessen sowohl über die nukleäre Fluoreszenz als auch über die sezernierte Nanoluciferase, erwiesen sich als konzentrationsabhängig. Die parallel per Immunoblot verfolgte Expression des CYP1A1-Proteins bestätigte dieses Profil mit einer dosisabhängigen Induktion unter B[a]P. Die drei Zelltypen zeigten unter 2 µM B[a]P jedoch nicht denselben Aktivierungsgrad, wobei die Induktion in den Zytotrophoblasten etwa das Vierfache, in den NIH/3T3 das Zweifache und in den BeWo nur das 1,2-Fache erreichte, was auf einen gewissen Anteil an Zellspezifität hindeutet. Die Autoren stellen außerdem eine nukleäre Lokalisation des AHR und eine basale Aktivierung fest, die möglicherweise mit endogenen Liganden wie Kynurenin oder mit im Kulturmedium vorhandenen Verbindungen zusammenhängen.
Diese beiden Systeme ergänzen die bestehenden Werkzeuge und bieten dabei bemerkenswerte Vorteile: Kompatibilität mit verschiedenen Zelltypen und Spezies sowie das Ausbleiben einer Zelllyse. Die sezernierte Nanoluciferase zeichnet sich durch ihre Empfindlichkeit aus, da sie nur ein geringes Volumen an Überstand erfordert, während der fluoreszierende Reporter eine Verfolgung mittels Bildgebung an lebenden Zellen und eine Analyse der Kinetik in Echtzeit ermöglicht. Diese Plasmide eröffnen den Weg zu verschiedenen Anwendungen, insbesondere zum Screening endogener oder exogener AHR-Liganden.