Die Antigenpräsentation durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I ist ein entscheidender Schritt der adaptiven Immunität: Sie ermöglicht es zytotoxischen T-Lymphozyten, infizierte oder abnorme Zellen zu erkennen. Um effizient präsentiert zu werden, müssen die antigenen Peptide eine genaue Länge von acht bis zehn Resten erreichen, damit sie sich korrekt in die Furche des MHC-I-Moleküls einfügen. Im endoplasmatischen Retikulum beruht diese Kalibrierung auf der Wirkung zweier humaner Aminopeptidasen, ERAP1 und ERAP2, die nacheinander Aminosäuren vom Ende der Vorläuferpeptide entfernen. Ein genaues Verständnis dieses Zuschneideschritts und seiner Regulation ist unerlässlich, um zu erfassen, wie sich das an der Zelloberfläche präsentierte Peptidrepertoire zusammensetzt.
Während die Vorstellung, dass die ERAP freie Peptide zuschneiden, weithin anerkannt ist, deuten Daten aus In-vitro- und zellulären Experimenten darauf hin, dass diese Enzyme auch auf Peptide einwirken können, die an MHC-I-Moleküle gebunden oder teilweise gebunden sind – eine Konfiguration, die der physiologischen Situation vermutlich näher kommt. Um diese Vielseitigkeit zu untersuchen, beschreiben die Autoren ein vollständiges experimentelles Protokoll, das es ermöglicht, die Entfernung der Reste durch die ERAP Schritt für Schritt zu verfolgen. Die Methode umfasst zunächst die Herstellung löslicher rekombinanter ERAP1/ERAP2-Komplexe in Form von Heterodimeren. Diese Proteine werden in Insektenzellen exprimiert, wobei die Hi5-Linien bevorzugt werden, da sie mehr rekombinantes Protein sezernieren als Sf9-Zellen, und zwar in einem serumfreien Medium, dessen Fehlen von Proteasen die Stabilität der sezernierten Enzyme begünstigt. Die ERAP-Komplexe werden anschließend kovalent an Sepharose-Beads immobilisiert, was serielle Immunpräzipitationen erleichtert und die Kontamination durch Antikörper bei der Quantifizierung begrenzt.
Der eigentliche Zuschneidetest besteht darin, ein Vorläuferpeptid in freier oder an MHC I gebundener Form mit den kalibrierten ERAP1/2-Beads zu inkubieren und anschließend die entstandenen Fragmente mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Ein Kontrollpeptid aus fünfzehn Resten dient dazu, jede neue Bead-Charge zu standardisieren und die Ergebnisse zwischen den Experimenten zu normalisieren. Die Autoren betonen, dass freie Peptide deutlich schneller zugeschnitten werden als an MHC I gebundene Peptide, was es erforderlich macht, die Probenahmezeiten an das Ziel jedes Experiments anzupassen. Die Präparation der peptiddefizienten MHC-I-Moleküle, die intrinsisch instabil sind und durch Glycerol stabilisiert werden, sowie das kontrollierte Beladen mit synthetischen Peptiden aus neun Resten oder mit an ihrem N-terminalen Ende verlängerten Vorläufern vervollständigen den Aufbau.
Indem es ermöglicht, das Zuschneiden sowohl freier als auch an MHC I gebundener Peptide zu verfolgen, bietet dieses Protokoll ein Werkzeug, um Zuschneideereignisse zu charakterisieren und die Rolle der ERAP bei der Zusammensetzung des den zytotoxischen T-Lymphozyten präsentierten Peptidrepertoires besser einzugrenzen.