Das Bindegewebe bildet ein dreidimensionales Netzwerk aus Fibroblasten und extrazellulärer Matrix, das den Bewegungsapparat stützt und während der Entwicklung eine entscheidende Rolle spielt, insbesondere indem es den Muskelzellen Positionsinformationen liefert. Bei Wirbeltieren umfasst dieses Gewebe das muskuläre Bindegewebe – dessen aufeinanderfolgende Schichten, Epimysium, Perimysium und Endomysium, jeweils die Muskeln, die Faserbündel und die einzelnen Fasern umgeben – sowie die Sehne, die ihrerseits von dünnen fibroblastischen Schichten umhüllt ist. Trotz dieser Bedeutung bleibt das Verständnis der Differenzierungsprogramme der Fibroblasten begrenzt, was größtenteils darauf zurückzuführen ist, dass diese Zellen sehr heterogen und schlecht charakterisiert sind. Im Unterschied zur Muskellinie steuert kein Mastergen die Differenzierung zur Dermis, zum muskulären Bindegewebe oder zur Sehne, auch wenn für jede dieser Strukturen anerkannte Marker existieren, wie etwa TWIST2 für die Dermis, Scleraxis (SCX) für die Sehne und OSR1 für eine Population fibro-adipogener Vorläuferzellen.
Um diese Vielfalt zu untersuchen, kombinierten die Autoren mehrere Ansätze der Einzelzell-RNA-Sequenzierung, darunter die Trajektorien-Inferenz, mit In-situ-Hybridisierungsanalysen, angewandt auf die fetale Extremitätenentwicklung des Huhns. Die Trajektorien-Inferenz wurde insbesondere mit der STREAM-Pipeline durchgeführt, während die In-situ-Hybridisierungen, einfach oder doppelt, kolorimetrisch oder fluoreszierend, die Lokalisierung der Markerexpression auf Extremitätenschnitten in den Embryonalstadien E6 und E10 ermöglichten, mit Immunmarkierung der schweren Ketten des sarkomerischen Myosins zur Identifizierung der Muskeln. Die Hybridisierungs- und immunhistochemischen Experimente wurden an mindestens drei Extremitäten verschiedener Embryonen durchgeführt.
Diese Arbeiten zeigen, dass die Fibroblasten zu Beginn der fetalen Periode von einem auf Positionsinformationen beruhenden Programm zu einem Programm der Liniendiversifizierung übergehen. Das muskuläre Bindegewebe und die Sehne bestehen aus mehreren Fibroblastenpopulationen, die asynchron entstehen. Sobald das definitive Muskelmuster etabliert ist, nehmen die transkriptionell verwandten Populationen benachbarte Lokalisationen in der Extremität ein und deuten damit die bei Erwachsenen beobachteten fibroblastischen Schichten vorweg.
Ausgehend von diesen Beobachtungen schlagen die Autoren vor, dass sich das Bindegewebe der Extremität in einem Kontinuum „promiskuitiver" fibroblastischer Identitäten organisiert, das heißt schwach abgegrenzt und zwischen benachbarten Populationen verwandt. Diese Organisation würde eine robuste und effiziente Verbindung des Muskels mit dem Knochen und der Haut gewährleisten. Die Studie liefert somit eine Kartierung der fibroblastischen Vielfalt und ihrer entwicklungsbiologischen Trajektorien, da diese Programme im Vergleich zu denen der Muskellinie bisher kaum beschrieben waren.