Die Analyse der zellulären Stressantwort und insbesondere der Mechanismen der DNA-Reparatur erfordert heute Ansätze, die zahlreiche Parameter auf der Ebene der einzelnen Zelle quantifizieren können. Die quantitative bildbasierte Zytometrie oder QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry) erfüllt diesen Bedarf: Angewandt mittels Fluoreszenzmikroskopie auf große Populationen asynchroner adhärenter Zellen ermöglicht sie es, das Zellzyklusstadium jeder einzelnen Zelle zu bestimmen und gleichzeitig die Signale interessierender Proteine zu messen. Dennoch bleibt diese Technik weitgehend von High-Content-Mikroskopieplattformen und proprietärer Analysesoftware abhängig. Die wesentlichen Hindernisse liegen in der Automatisierung der Erfassung und Analyse, die eine zuverlässige Segmentierung jedes Zellkerns in Verbindung mit einer unverzerrten Extraktion multipler Parameter voraussetzt.
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine vollständige und offen zugängliche Lösung, von der Vorbereitung, Behandlung und Fixierung der Zellen bis hin zur Färbung, Mikroskopie und Bildanalyse. Es stützt sich auf eine Weitfeldmikroskopie-Aufbau für die automatisierte mehrfarbige Erfassung sowie auf Skripte, die für die Software Fiji entwickelt wurden. Der zentrale Analyseschritt beruht auf StarDist, einem auf Deep Learning basierenden Werkzeug, das darauf trainiert ist, Zellkerne zu erkennen. Im Gegensatz zur klassischen Schwellenwertmethode, die ausschließlich die Fluoreszenzintensität nutzt, verwendet StarDist mehrere morphologische Merkmale, was eine präzise und vollständig automatisierte Segmentierung selbst bei dicht gruppierten Zellkernen mit minimalem Eingriff des Anwenders gewährleistet. Die Gesamtintensität des DAPI pro Zellkern dient als Schätzung des DNA-Gehalts, und die Kombination mit dem mittleren EdU-Signal ermöglicht die Einteilung der Zellen in die Phasen G1, S und G2. Anschließend werden zusätzliche Parameter, wie die mittlere Intensität oder die Anzahl der Foci pro Zellkern für die untersuchten Proteine, extrahiert und dann multiparametrisch visualisiert.
Die Gültigkeit des Ansatzes wird anhand der γH2AX- und 53BP1-Signale im Rahmen der DNA-Schadensantwort veranschaulicht. Die Autoren finden in bestrahlten Zellen in der G2-Phase etwa doppelt so viele γH2AX-Foci wie in der G1-Phase, in Übereinstimmung mit der Verdopplung des DNA-Gehalts. Zudem beobachten sie eine spezifische Aktivierung von γH2AX in der S-Phase nach durch Camptothecin induziertem Replikationsstress und zeigen, dass die auf den DNA-Gehalt normalisierte Anzahl der 53BP1-Foci in der G1-Phase höher ist und im Laufe des Zellzyklus abnimmt. Die Autoren weisen auf bestimmte Einschränkungen hin: Das StarDist-Standardmodell ist für Zelllinien mit ovoid-rundlichen Zellkernen geeignet, wie etwa U-2 OS oder RPE1-hTERT, wurde jedoch nicht an anderen Zelltypen getestet, und die Identifizierung diskreter Foci bleibt in Proben mit hoher Dichte oder heterogener Intensität schwierig. Insgesamt stellt dies ein schnelles und automatisiertes Verfahren zur QIBC-Analyse dar, begleitet von öffentlich zur Verfügung gestellten Fiji-Skripten.