L'analyse de la réponse cellulaire au stress, et en particulier des mécanismes de réparation de l'ADN, exige aujourd'hui des approches capables de quantifier de multiples paramètres à l'échelle de la cellule individuelle. La cytométrie quantitative basée sur l'image, ou QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry), répond à ce besoin : appliquée par microscopie de fluorescence à de larges populations de cellules adhérentes asynchrones, elle permet d'établir le stade du cycle cellulaire de chaque cellule tout en mesurant simultanément les signaux de protéines d'intérêt. Cette technique reste néanmoins largement tributaire de plateformes de microscopie à haut contenu et de logiciels d'analyse propriétaires. Les principaux obstacles tiennent à l'automatisation de l'acquisition et de l'analyse, qui suppose une segmentation fiable de chaque noyau couplée à une extraction non biaisée de paramètres multiples.
Le protocole décrit ici propose une solution complète et libre d'accès, depuis la préparation, le traitement et la fixation des cellules jusqu'à la coloration, l'imagerie et l'analyse d'images. Il s'appuie sur une configuration de microscope à fluorescence à champ large pour l'acquisition multicolore automatisée et sur des scripts développés pour le logiciel Fiji. L'étape clé d'analyse repose sur StarDist, un outil fondé sur l'apprentissage profond entraîné à reconnaître les noyaux. Contrairement à la méthode classique par seuillage, qui n'utilise que l'intensité de fluorescence, StarDist exploite plusieurs caractéristiques morphologiques, ce qui assure une segmentation précise et entièrement automatisée même en présence de noyaux densément regroupés, avec une intervention minimale de l'utilisateur. L'intensité totale du DAPI par noyau sert d'estimation du contenu en ADN, et le croisement avec le signal moyen d'EdU permet de répartir les cellules entre les phases G1, S et G2. Des paramètres supplémentaires, comme l'intensité moyenne ou le nombre de foyers par noyau pour les protéines étudiées, sont ensuite extraits puis visualisés de façon multiparamétrique.
La validité de l'approche est illustrée sur les signaux γH2AX et 53BP1 dans le cadre de la réponse aux dommages de l'ADN. Les auteurs retrouvent environ deux fois plus de foyers γH2AX dans les cellules irradiées en G2 qu'en G1, en cohérence avec le doublement du contenu en ADN, observent une activation spécifique de γH2AX en phase S après stress réplicatif induit par la camptothécine, et montrent que le nombre de foyers 53BP1 normalisé au contenu en ADN est plus élevé en G1 puis décline au fil du cycle. Les auteurs précisent certaines limites : le modèle StarDist par défaut est adapté aux lignées à noyaux ovoïdes-arrondis, telles que U-2 OS ou RPE1-hTERT, sans avoir été testé sur d'autres types cellulaires, et l'identification de foyers discrets reste délicate dans les échantillons à forte densité ou intensité hétérogène. L'ensemble constitue une procédure rapide et automatisée d'analyse QIBC, accompagnée de scripts Fiji mis à disposition publiquement.