Die Durchflusszytometrie analysiert die Zellen einer Suspension einzeln und im Hochdurchsatz: Mehrere Tausend, mitunter Zehntausende Zellen pro Sekunde werden dabei auf ihre Größe, ihre Granularität und die Expression eines Markerpanels hin untersucht. Sie beantwortet eine in der Biologie wiederkehrende Frage: Woraus besteht diese Probe, und in welchem Zustand befinden sich diese Zellen? Wo eine Gesamtmessung das Signal in einem Mittelwert ertränkt, gibt die Zytometrie die Verteilung Zelle für Zelle wieder.
Prinzip und Ablauf
Die Zellen in Suspension werden mit fluorochromgekoppelten Antikörpern markiert und dann einzeln an einem oder mehreren Lasern vorbeigeführt. Für jede Zelle erfasst das Gerät das gestreute Licht (Indikator für Größe und innere Struktur) und die von jedem Marker emittierte Fluoreszenz. Daraus werden durch eine sogenannte „Gating“-Analyse Subpopulationen abgeleitet, die durch ihre Markerkombinationen definiert sind – zum Beispiel aktivierte CD3+ CD8+ T-Lymphozyten.
Die Genauigkeit einer Analyse hängt ebenso von der Laborbank wie vom Gerät ab: Panelkonzeption (Kompatibilität der Fluorochrome, Hierarchie der Marker), Titration der Antikörper, Kompensationskontrollen und „Fluorescence-minus-one“ zur Festlegung der Positivitätsschwellen sowie Vitalitätsfärbung zum Ausschluss toter Zellen, die die Ergebnisse verfälschen. Diese oft in einer Publikation unsichtbaren Schritte bestimmen die Verlässlichkeit der Schlussfolgerungen.
Varianten und Optionen
Je nach Bedarf gibt es mehrere Ausprägungen. Die konventionelle Zytometrie genügt für bescheidene Panels; die spektrale Zytometrie, die den vollständigen spektralen Fingerabdruck jedes Fluorochroms ausliest, ermöglicht Panels von 30 Markern und mehr, wertvoll für die tiefe Immunphänotypisierung. Die Zellsortierung (FACS) begnügt sich nicht mit der Analyse: Sie isoliert die interessierenden Subpopulationen physisch – zum Beispiel antigenspezifische B-Lymphozyten –, um sie anschließend feinen molekularen Analysen wie der Einzelzellsequenzierung zu unterziehen. Über die Phänotypisierung hinaus machen funktionelle Assays (Proliferation, Vitalität, Zellzyklus, intrazelluläre Zytokinproduktion) das Zytometer zu einem echten Messstand für den Zellzustand.
Wann und warum diese Technik
Man greift auf die Durchflusszytometrie zurück, sobald Zellpopulationen in einem heterogenen Gemisch quantifiziert, eine Immunantwort verfolgt, lebende Zellen für einen späteren Schritt sortiert oder ein funktioneller Parameter an einer großen Zahl von Zellen gemessen werden soll. Sie ist schnell, quantitativ und statistisch robust.
Der Kompromiss ist klar. Sie verliert die räumliche Information: Man weiß, dass eine Zelle einen Marker exprimiert, aber nicht, wo sie sich im Gewebe befand – das ist die Domäne der Immunhistochemie. Sie setzt eine Zellsuspension voraus, also eine Dissoziation, die manche empfindlichen Epitope verändern kann. Die Zahl gleichzeitiger Marker bleibt durch die spektralen Überlappungen begrenzt (durch die spektrale Zytometrie abgeschwächt, aber nicht aufgehoben), und die Qualität hängt eng von der Vitalität der Probe ab. Für eine erschöpfende transkriptionelle Charakterisierung übernimmt die Einzelzellsequenzierung; die Zytometrie bleibt dann der vorgelagerte Sortierschritt.
Die Expertise von Inovarion
Inovarion stellt die Durchflusszytometrie in den Mittelpunkt der Analyse der menschlichen Immunantwort und konzipiert Panels und Gating-Strategien so nah wie möglich an der jeweiligen Fragestellung. Ihre veröffentlichten Arbeiten haben sie eingesetzt, um antigenspezifische B-Lymphozyten mittels FACS zu identifizieren und zu sortieren – etwa die gegen das Spike-Protein von SARS-CoV-2 gerichteten Gedächtnis-B-Zellen, nachgewiesen mithilfe fluoreszierender Antigensonden und dedizierter Gating-Strategien –, im Vorfeld ihrer Kultur und ihrer Einzelzellsequenzierung. Derselbe Ansatz diente der Charakterisierung der splenischen B-Populationen, die an den Rückfällen der Immunthrombozytopenie beteiligt sind. Über die Hämatologie hinaus erlaubte die Technik auch die Phänotypisierung nicht-immunologischer Populationen wie humaner Thymus-Epithelzellen in Kultur. Von der Panelkonzeption bis zur Sortierung lebender Zellen passt Inovarion die Strategie an das wissenschaftliche Ziel an.
Siehe auch: Single-Cell-RNA-Seq (Zellsortierung im Vorfeld der Sequenzierung).
Wichtige Publikationen
- Sokal et al. Maturation and persistence of the anti-SARS-CoV-2 memory B cell response. Cell, 2021. Eintrag → · PubMed
- Crickx et al. Rituximab-resistant splenic memory B cells and newly engaged naive B cells fuel relapses in patients with immune thrombocytopenia. Science Translational Medicine, 2021. Eintrag → · PubMed
- Villegas et al. Cultured Human Thymic-Derived Cells Display Medullary Thymic Epithelial Cell Phenotype and Functionality. Frontiers in Immunology, 2018. PubMed