Der aktivierte Faktor VII (FVIIa) spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung der Blutgerinnung. Diese Serinprotease, die aus einem Vitamin-K-abhängigen Vorläufer hervorgeht, entfaltet im freien Zustand jedoch nur eine geringe enzymatische Aktivität: Ihr aktives Zentrum bleibt unreif, da sich das N-terminale Ende ihrer Proteasedomäne nicht korrekt in die katalytische Tasche einfügt. Erst die Bindung an ihren Kofaktor, den Gewebefaktor (TF), stabilisiert diese Insertion und verstärkt die Aktivität von FVIIa erheblich, sowohl gegenüber seinen Proteinsubstraten als auch gegenüber kleinen synthetischen Substraten. Diese Abhängigkeit vom TF wirft eine lange diskutierte Frage auf: Beruht die therapeutische Wirkung von FVIIa, das insbesondere zur Wiederherstellung der Hämostase bei Fehlen von Faktor VIII eingesetzt wird, auf einem TF-abhängigen oder TF-unabhängigen Mechanismus?
Um diese Frage zu klären, versuchten die Autoren, einen Einzeldomänen-Antikörper (sdAb) zu generieren, der selektiv freien FVIIa anstelle von TF-gebundenem FVIIa erkennen kann. Durch das Screening einer aus einem immunisierten Lama gewonnenen Phagenbibliothek konnte ein Kandidat isoliert werden, der als KB-FVIIa-004 bezeichnet wurde. Dieser Antikörper bindet an FVIIa, nicht aber an seinen Vorläufer FVII oder an homologe Proteine wie Prothrombin oder Faktor X und deren aktivierte Derivate. Er hemmt kompetitiv die amidolytische Aktivität von FVIIa (Ki von 28 bis 45 nM) sowie die durch FVIIa vermittelte Aktivierung von Faktor X (Ki von 26 nM).
Das Verhalten des Antikörpers ändert sich in Gegenwart von TF grundlegend. So bleiben die amidolytische Aktivität des FVIIa/TF-Komplexes und die von ihm vermittelte Aktivierung von FX unverändert, selbst bei einem 50- bis 1000-fachen molaren Überschuss an KB-FVIIa-004. Die Zugabe von TF zu zuvor gehemmtem FVIIa stellt dessen Aktivität im Übrigen wieder her, und eine Verlängerung der Quick-Zeit tritt erst bei sehr hohem Überschuss des Antikörpers auf. Die Autoren vermuten, dass KB-FVIIa-004 ein kryptisches Epitop in der Nähe des aktiven Zentrums erkennt, das nur im Zymogen-Zustand von FVIIa exponiert ist: Bindet die Protease an ein Substrat oder an TF, nimmt sie ihre aktive Konformation ein, und das Epitop verschwindet, was den gegenseitigen Ausschluss von TF und Antikörper erklären würde.
Für einen In-vivo-Test wurde ein KB-FVIIa-004/Albumin-Fusionsprotein (004-HSA) hergestellt. Bei Faktor-VIII-defizienten Mäusen blockierte dieses Molekül die Fähigkeit von FVIIa, die Blutung zu korrigieren: Ein zehnfacher molarer Überschuss ließ den Blutverlust wieder auf das Niveau unbehandelter Tiere ansteigen. Da humanes FVIIa nur schwach mit murinem TF interagiert, sind diese Ergebnisse mit einer therapeutischen Wirkung von FVIIa vereinbar, die eher bei Abwesenheit von TF zum Tragen kommt. Die Autoren beschreiben somit den ersten Antikörper, der spezifisch die TF-unabhängige Aktivität von FVIIa blockiert – ein nützliches Werkzeug, um die jeweiligen Rollen von freiem und TF-gebundenem FVIIa sowohl in vitro als auch in vivo zu untersuchen.