Die funktionelle Genomik verbindet ein Gen mit einer Funktion, indem sie es stört und dann den resultierenden Phänotyp beobachtet. Zwei große Werkzeugfamilien eignen sich dafür: die Genomeditierung (CRISPR-Cas9, die die DNA verändert) und die RNA-Interferenz (siRNA/shRNA, die die messenger-RNA reduziert), meist über einen lentiviralen Vektor verabreicht. Die gestellte Frage ist einfach: Was geschieht, wenn dieses Gen abgeschaltet wird, und was lernt man über seine Rolle?
Prinzip und Ablauf
Bei CRISPR-Cas9 lenkt eine Leit-RNA (sgRNA) die Nuklease Cas9 zu einer Zielsequenz, wo sie einen Doppelstrangbruch einführt. Die Reparatur durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) erzeugt dort Insertionen/Deletionen, die das Gen inaktivieren – das ist der Knockout; ein präziser Knock-in nutzt hingegen die homologiegerichtete Reparatur (HDR) anhand einer Vorlage. Bei der RNA-Interferenz rekrutiert eine kleine RNA (siRNA, transient; shRNA, stabil) die zelluläre Maschinerie, um die Ziel-mRNA abzubauen: Das Gen wird „abgeschaltet“ (Knockdown), ohne den genetischen Code zu verändern.
Die Verabreichung erfolgt durch Transfektion (transiente Wirkung) oder durch lentivirale Transduktion (stabile Integration, dauerhafte Expression von Cas9/sgRNA oder des shRNA). In allen Fällen wird der Funktionsverlust validiert – Western Blot, qPCR, Sequenzierung – vor der phänotypischen Analyse, ein Schritt, der die Verlässlichkeit der Schlussfolgerungen bestimmt.
Varianten und Optionen
Über den Knockout eines einzelnen Gens hinaus führt das gepoolte CRISPR-Screening eine Bibliothek von Tausenden sgRNA in eine Population ein – jede Zelle trägt dann einen anderen Knockout – und identifiziert dann durch Selektion und Sequenzierung die essenziellen Gene oder die Vulnerabilitäten (Analyse vom Typ MAGeCK). Weitere Ausprägungen vermeiden den DNA-Schnitt: das Base Editing und das Prime Editing (Modifikationen ohne Doppelstrangbruch) oder die CRISPRi/CRISPRa (transkriptionelle Repression oder Aktivierung). Auf Seiten der RNA-Interferenz bietet die siRNA eine transiente Abschaltung, das lentivirale shRNA eine stabile Abschaltung. Die Screenings können arrayed (Gen für Gen) oder gepoolt durchgeführt werden.
Wann und warum diese Techniken
Man setzt diese Ansätze ein, um eine Kausalität zu etablieren (verursacht dieses Gen diesen Phänotyp?), eine therapeutische Zielstruktur zu validieren oder in großem Maßstab Vulnerabilitäten durch Screening zu entdecken. Die Wahl zwischen Editierung und Interferenz hängt vom Ziel ab: CRISPR liefert eine dauerhafte und vollständige Inaktivierung; die RNA-Interferenz eine partielle und modulierbare Abschaltung, wertvoll, wenn ein vollständiger Knockout letal wäre, oder um eine dosisabhängige Wirkung zu titrieren.
Keines dieser Werkzeuge ist ohne Kehrseite. Bei CRISPR sind mehrere Grenzen zu beherrschen: die Off-Target-Effekte (Schnitte an unerwünschten Stellen), ein unvollständiger oder mosaikartiger Knockout (Indels im Leseraster, die die Funktion erhalten) und vor allem die Toxizität der Doppelstrangbrüche, die in primären oder nicht transformierten Zellen eine p53-Antwort auslösen und die Screenings verfälschen können; der Knock-in per HDR bleibt wenig effizient, und die dauerhafte Inaktivierung ist bei essenziellen Genen problematisch. Bei der RNA-Interferenz ist der Knockdown unvollständig und variabel (es bleibt Rest-mRNA), mit sequenzabhängigen Off-Target-Effekten, und im Fall der siRNA transient. Um die Toxizität der Schnitte zu umgehen, kann man auf die CRISPRi (Repression ohne Schnitt) oder auf induzierbare Systeme zurückgreifen; die lentivirale Verabreichung schließlich erfordert Biosicherheitsvorkehrungen und eine zu dokumentierende semizufällige Integration.
Die Expertise von Inovarion
Inovarion nutzt die funktionelle Genomik, um Zielstrukturen zu validieren und Mechanismen zu sezieren, in der Onkologie wie in der Immunologie. Ihre veröffentlichten Arbeiten haben den CRISPR-Cas9-Knockout – gekoppelt an eine konditionale In-vivo-Deletion – eingesetzt, um zu zeigen, dass ein endosomales Kompartiment für die Signalübertragung des T-Zell-Rezeptors und für die Antitumorantwort essenziell ist; ein gepooltes CRISPR-Cas9-Screening, ausgehend von einer Bibliothek von Chromatinregulatoren, um eine Vulnerabilität des metastasierten Aderhautmelanoms zu identifizieren und als therapeutische Zielstruktur zu validieren; und die Abschaltung durch RNA-Interferenz, um die Rolle eines Mammakarzinom-Biomarkers bei der Zellmigration und der Reaktion auf Paclitaxel zu sezieren. Von der Störungsstrategie – Editierung, Screening oder RNA-Interferenz und ihre Verabreichungsart – bis zur Validierung des Funktionsverlusts und zur phänotypischen Analyse wird jeder Schritt von der zu untersuchenden Biologie vorgegeben.
Siehe auch: Single-Cell-RNA-Seq (transkriptionelle Auslesung der Störungen); In-vivo- und präklinische Modelle.
Wichtige Publikationen
- Evnouchidou et al. IRAP-dependent endosomal T cell receptor signalling is essential for T cell responses. Nature Communications, 2020. PubMed
- Krossa et al. SETDB1 is critically required for uveal melanoma growth and represents a promising therapeutic target. Cell Death & Disease, 2025. PubMed
- Rodrigues-Ferreira et al. ATIP3 deficiency facilitates intracellular accumulation of paclitaxel to reduce cancer cell migration and lymph node metastasis in breast cancer patients. Scientific Reports, 2020. PubMed