La génomique fonctionnelle relie un gène à une fonction en le perturbant, puis en observant le phénotype qui en résulte. Deux grandes familles d’outils s’y prêtent : l’édition du génome (CRISPR-Cas9, qui modifie l’ADN) et l’interférence ARN (siRNA/shRNA, qui réduit l’ARN messager), le plus souvent délivrées par vecteur lentiviral. La question posée est simple : qu’advient-il quand ce gène est éteint, et qu’apprend-on de son rôle ?
Principe et déroulé
En CRISPR-Cas9, un ARN guide (sgRNA) dirige la nucléase Cas9 vers une séquence cible où elle introduit une cassure double-brin. La réparation par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) y génère des insertions/délétions qui inactivent le gène — c’est le knockout ; un knock-in précis exploite, lui, la réparation dirigée par homologie (HDR) à partir d’une matrice. En interférence ARN, un petit ARN (siRNA, transitoire ; shRNA, stable) recrute la machinerie cellulaire pour dégrader l’ARNm cible : le gène est « éteint » (knockdown) sans modifier le code génétique.
La délivrance se fait par transfection (effet transitoire) ou par transduction lentivirale (intégration stable, expression durable de Cas9/sgRNA ou du shRNA). Dans tous les cas, la perte de fonction est validée — western blot, qPCR, séquençage — avant l’analyse phénotypique, étape qui conditionne la fiabilité des conclusions.
Variantes et options
Au-delà du knockout d’un gène isolé, le crible CRISPR poolé introduit une bibliothèque de milliers de sgRNA dans une population — chaque cellule porte alors un knockout différent — puis identifie, par sélection et séquençage, les gènes essentiels ou les vulnérabilités (analyse de type MAGeCK). D’autres déclinaisons évitent la coupure de l’ADN : l’édition de base et le prime editing (modifications sans cassure double-brin), ou la CRISPRi/CRISPRa (répression ou activation transcriptionnelle). Côté interférence ARN, le siRNA offre une extinction transitoire, le shRNA lentiviral une extinction stable. Les cribles peuvent être conduits en réseau (« arrayed », gène par gène) ou en pool.
Quand et pourquoi ces techniques
On mobilise ces approches pour établir une causalité (ce gène cause-t-il ce phénotype ?), valider une cible thérapeutique, ou découvrir des vulnérabilités à grande échelle par criblage. Le choix entre édition et interférence dépend de l’objectif : CRISPR procure une inactivation permanente et complète ; l’interférence ARN, une extinction partielle et modulable, précieuse quand un knockout total serait létal ou pour titrer un effet dose-dépendant.
Aucun de ces outils n’est sans contrepartie. Pour CRISPR, plusieurs limites sont à maîtriser : les effets hors-cible (coupures à des sites non désirés), un knockout incomplet ou mosaïque (indels en phase conservant la fonction), et surtout la toxicité des cassures double-brin, qui déclenchent une réponse p53 dans les cellules primaires ou non transformées et peuvent fausser les cribles ; le knock-in par HDR reste peu efficace, et l’inactivation permanente est problématique pour les gènes essentiels. Pour l’interférence ARN, le knockdown est incomplet et variable (de l’ARNm résiduel subsiste), avec des effets hors-cible liés à la séquence, et transitoire dans le cas du siRNA. Pour contourner la toxicité des coupures, on peut recourir à la CRISPRi (répression sans cassure) ou à des systèmes inductibles ; la délivrance lentivirale, enfin, impose des précautions de biosécurité et une intégration semi-aléatoire à documenter.
L’expertise d’Inovarion
Inovarion exploite la génomique fonctionnelle pour valider des cibles et disséquer des mécanismes, en oncologie comme en immunologie. Ses travaux publiés ont mobilisé le knockout CRISPR-Cas9 — couplé à une délétion conditionnelle in vivo — pour démontrer qu’un compartiment endosomal est essentiel à la signalisation du récepteur des lymphocytes T et à la réponse anti-tumorale ; un crible CRISPR-Cas9 poolé, à partir d’une bibliothèque de régulateurs de la chromatine, pour identifier une vulnérabilité du mélanome uvéal métastatique et la valider comme cible thérapeutique ; et l’extinction par interférence ARN pour disséquer le rôle d’un biomarqueur du cancer du sein dans la migration cellulaire et la réponse au paclitaxel. De la stratégie de perturbation — édition, criblage ou interférence ARN, et son mode de délivrance — jusqu’à la validation de la perte de fonction et l’analyse phénotypique, chaque étape est dictée par la biologie à interroger.
Voir aussi : Single-cell RNA-seq (lecture transcriptionnelle des perturbations) ; Modèles in vivo & précliniques.
Publications clés
- Evnouchidou et al. IRAP-dependent endosomal T cell receptor signalling is essential for T cell responses. Nature Communications, 2020. PubMed
- Krossa et al. SETDB1 is critically required for uveal melanoma growth and represents a promising therapeutic target. Cell Death & Disease, 2025. PubMed
- Rodrigues-Ferreira et al. ATIP3 deficiency facilitates intracellular accumulation of paclitaxel to reduce cancer cell migration and lymph node metastasis in breast cancer patients. Scientific Reports, 2020. PubMed