Die Proteomik misst die Proteine – die effektorische Ebene des Lebendigen, die das Transkriptom nur unvollkommen vorhersagt. Mittels Massenspektrometrie identifiziert und quantifiziert man Tausende von Proteinen in einer Probe, detektiert Modifikationen, vergleicht einen Tumor mit seinem gesunden Gewebe. Wo die RNA angibt, was produziert werden könnte, misst die Proteomik, was tatsächlich vorhanden ist.
Prinzip und Ablauf
Der dominierende Ansatz wird bottom-up (oder shotgun) genannt: Die Proteine werden durch eine Protease (meist Trypsin) in Peptide verdaut, durch Flüssigchromatografie – oft im Nano-Durchfluss – getrennt, dann in der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ionisiert und fragmentiert. Algorithmen gleichen die erfassten Spektren mit einer Sequenzdatenbank ab, um die Peptide zu identifizieren und die Proteine abzuleiten, unter Kontrolle einer Falsch-Positiv-Rate (FDR, typischerweise 1 % per Target-Decoy-Strategie). Die Quantifizierung erfolgt markierungsfrei (label-free) oder durch Isotopenmarkierung (TMT, SILAC), um Bedingungen zu vergleichen, oder gezielt (MRM/PRM), um ein Panel ausgewählter Proteine genau zu verfolgen.
Varianten und Optionen
Man unterscheidet die Entdeckung (shotgun, breit und unvoreingenommen) von der gezielten Proteomik (MRM/PRM, sensitiv und quantitativ an definierten Zielen) sowie das Label-free von der Markierung (TMT/iTRAQ, SILAC). Die Proteogenomik reichert die Sequenzdatenbank mit den genomischen und transkriptomischen Daten derselben Probe an, um Varianten zu identifizieren, die in den öffentlichen Datenbanken fehlen. Hinzu kommen Spezialgebiete: Phosphoproteomik und Kartierung der posttranslationalen Modifikationen, Immunpeptidomik, Interaktomik durch Affinitätsreinigung (AP-MS) sowie die Erfassungsmodi DDA oder DIA.
Wann und warum diese Techniken
Man wendet sich der Proteomik zu, wenn die Frage die Proteine selbst betrifft: ihr Expressionsniveau (das nur unvollkommen mit dem der mRNA korreliert), ihre Modifikationen, die Identifizierung von Sequenzvarianten oder ein differenzieller Vergleich zwischen Tumor und gesundem Gewebe. Sie ergänzt die Transkriptomik, ohne sie zu ersetzen – häufig erscheinen auf Proteinebene angereicherte Wege nicht in den RNA-Daten.
Mehrere Grenzen belasten die Interpretation. Der Dynamikbereich ist die größte Herausforderung: Sehr häufige Proteine verdecken die selteneren, ein im Plasma extremes Phänomen. Die Abdeckung des Proteoms bleibt unvollständig, mit fehlenden Werten von einer Probe zur anderen; die Ableitung der Proteine aus Peptiden ist mitunter mehrdeutig (zwischen mehreren Proteinen geteilte Peptide); das Bottom-up identifiziert Spleißvarianten schlecht und kartiert die posttranslationalen Modifikationen nicht erschöpfend. Die Identifizierung von Sequenzvarianten erfordert eine angereicherte Datenbank, andernfalls entgehen die realen Formen den generischen Datenbanken. Schließlich bleiben hydrophobe oder membranständige, sehr hochmolekulare oder sehr variable Proteine (wie PfEMP1) technisch anspruchsvoll, und die Label-free-Quantifizierung erfordert eine sorgfältige Normalisierung.
Die Expertise von Inovarion
Inovarion setzt die Massenspektrometrie ein, um Proteinfragen zu beantworten, in der Onkologie wie in der Infektiologie. Mehrere Beispiele wurden veröffentlicht: Die Integration von Proteomik, Genomik und Transkriptomik verfeinerte die molekulare Klassifikation des Blasenkarzinoms und offenbarte eine therapeutische Sensitivität – die durch TRAIL induzierte Apoptose in FGFR3-mutierten Tumoren –, die das Transkriptom allein nicht erfasste; ein proteogenomischer Ansatz auf Grundlage einer angereicherten Sequenzdatenbank erlaubte es, schwer zu identifizierende Varianten des Proteins PfEMP1 bei der schweren Malaria zu rekonstruieren; und die differenzielle Massenspektrometrie, ergänzt durch ein gezieltes MRM, quantifizierte die Exozytose-Proteine beim Phäochromozytom. Entdeckung oder Zielsetzung, Markierung oder Label-free, Probenvorbereitung: Alles hängt von der gestellten Frage ab.
Siehe auch: Bulk-RNA-Seq & differenzielle Transkriptomik; Co-Immunpräzipitation & Proteininteraktionen; Bioinformatik.
Wichtige Publikationen
- Groeneveld et al. Proteogenomic Characterization of Bladder Cancer Reveals Sensitivity to Apoptosis Induced by Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand in FGFR3-mutated Tumors. European Urology, 2024. Eintrag → · PubMed
- Kamaliddin et al. From genomic to LC-MS/MS evidence: Analysis of PfEMP1 in Benin malaria cases. PLoS One, 2019. PubMed
- Houy et al. Dysfunction of calcium-regulated exocytosis at a single-cell level causes catecholamine hypersecretion in patients with pheochromocytoma. Cancer Letters, 2022. Eintrag → · PubMed