Le séquençage en cellule unique se présente comme une technique d’analyse. C’est d’abord une technique de préparation. Entre le prélèvement et la première lecture, il faut séparer les cellules les unes des autres, les maintenir vivantes, les acheminer intactes jusqu’à la capture , et chacune de ces étapes décide de ce que l’expérience pourra montrer.
Cette note expose ce que la dissociation fait réellement au tissu, pourquoi certaines populations disparaissent sans laisser de trace, les décisions qui engagent tout le reste, et ce que l’analyse ne rattrape pas. Deux travaux auxquels Inovarion a contribué servent d’illustration, l’un sur sang, l’autre sur tissu solide.
Ce que la dissociation fait au tissu
Deux effets se superposent, et il importe de ne pas les confondre car ils n’appellent pas les mêmes parades.
Elle modifie la composition
Toutes les cellules ne se libèrent pas avec la même facilité. Selon l’enzyme, la durée, la température et l’agitation, certaines populations sont surreprésentées, d’autres appauvries, et les plus fragiles simplement détruites. Les proportions observées dans les données ne sont donc pas celles du tissu. Une évaluation systématique de ces biais, portant à la fois sur la dissociation et sur les conditions de conservation, a comparé les chaînes de traitement en cellule entière et en noyau isolé [2].
Et elle fabrique un signal
Le second effet est plus troublant, parce qu’il ne se traduit pas par une perte mais par une production : la dissociation induit dans une partie des cellules un programme de réponse au stress [1]. L’artefact n’est donc pas du bruit de mesure mais une réponse transcriptionnelle réelle, déclenchée par le traitement lui-même , ce qui le rend interprétable, et par là trompeur.
Le mécanisme est bien établi. La dissociation enzymatique classique impose une incubation à 37 °C, température à laquelle la cellule transcrit activement et réagit donc à ce qu’on lui fait subir. Une équipe a exploité cette propriété en sens inverse, en recourant à une protéase active à froid purifiée d’un micro-organisme psychrophile : la procédure entière se déroule à 6 °C ou moins, température à laquelle la machinerie transcriptionnelle des mammifères est largement inactive, ce qui revient à « figer » les profils d’expression tels qu’ils étaient in vivo. Comparée à des protocoles à 37 °C sur plus de vingt mille cellules, cette approche réduit fortement les artefacts d’expression [3]. Le principe a ensuite été transposé aux tumeurs solides, où il limite les réponses de stress associées à la collagénase [4].
Un détail achève de rendre l’artefact trompeur. Il n’atteint pas les cellules au hasard : les auteurs constatent qu’une sous-population d’ostéoblastes, cellules difficiles à libérer du tissu, porte la même signature de stress que les cellules souches affectées [1]. Lorsque l’artefact se trouve ainsi corrélé au type cellulaire, il peut être lu comme une propriété de la population plutôt que comme une trace du protocole.
Au-delà du choix de protéase, la parade la plus sûre reste de prévoir dès la conception les moyens de distinguer l’artefact de la biologie : conditions comparées, témoins traités différemment, ou vérification sur une modalité qui ne dissocie pas.
Le cas difficile : les granulocytes
L’illustration la plus nette de ces difficultés vient d’une population que la plupart des jeux de données ignorent purement et simplement.
Dans les études menées sur plateforme en gouttelettes, les neutrophiles sont complètement absents ou très rarement représentés. Or la cytométrie établit qu’ils constituent 10 à 20 % des leucocytes des tissus tumoraux pulmonaires et des tissus adjacents, sur une série de 63 échantillons. Cette sous-représentation est donc d’origine technique, et ses causes se cumulent : ce sont des cellules fragiles, à demi-vie circulatoire de sept à dix heures chez l’humain, particulièrement sensibles aux manipulations, et qui expriment une quantité exceptionnellement faible de molécules d’ARN messager [5]. À ces propriétés s’ajoutent une teneur élevée en RNases — les deux, faible teneur en ARN messager et abondance de nucléases, étant précisément ce qui rend leur profilage difficile [6] — ainsi qu’une perte à la cryoconservation.
Ce que cette étude a fait de cette difficulté est l’argument le plus convaincant en faveur d’une préparation soignée. Les auteurs ont intégré près de 1,3 million de cellules provenant de 556 échantillons et 318 patients, en y ajoutant leur propre jeu de données conçu pour capturer les cellules à faible contenu en ARN. Cette analyse a révélé des sous-populations de neutrophiles résidents acquérant de nouvelles propriétés fonctionnelles dans le microenvironnement , et la signature génique qui en dérive s’est trouvée associée à l’échec du traitement anti-PD-L1 [5].
Autrement dit, la population que la préparation d’échantillon faisait perdre était celle qui portait le signal clinique.
Deux cas, deux matrices
Un travail auquel Inovarion a contribué s’est attaqué à cette même population dans un contexte hématologique. Les granulocytes immatures de patients atteints de leucémie myélomonocytaire chronique ont été détectés et quantifiés par cytométrie en flux, puis soumis à un séquençage global et en cellule unique, lequel a révélé leur profil pro-inflammatoire — CXCL8 étant la cytokine la plus abondamment sécrétée. L’accumulation de ces cellules s’est révélée un facteur pronostique péjoratif puissant et indépendant [8]. Séquencer en cellule unique des granulocytes n’est donc pas hors de portée ; cela suppose de traiter la fragilité comme une contrainte de conception, non comme un aléa. Nous revenons sur le tri de cette population dans notre note sur les panels de cytométrie, et sur le choix entre séquençage global et en cellule unique.
Le sang, toutefois, dispense de dissocier. Un second travail auquel Inovarion a contribué illustre le cas du tissu solide : des lymphocytes B mémoire spécifiques d’un antigène viral ont été isolés à partir de rates de donneurs d’organes, chez des personnes vaccinées plus de quarante ans auparavant, puis caractérisés par séquençage en cellule unique [9]. S’ajoutent alors les deux difficultés propres au tissu : la dissociation elle-même, et le tri d’une population dont la fréquence est infime — la seconde n’ayant de sens que si la première n’a pas détruit ce qu’on cherche.
Les décisions qui engagent tout le reste
Cellules entières ou noyaux isolés
Lorsque la cellule ne survit pas à la dissociation, le noyau peut y résister. L’isolement de noyaux permet ainsi d’aborder des tissus congelés ou des types cellulaires trop fragiles. Le prix est connu : on perd le transcriptome cytoplasmique, et les profils obtenus ne sont pas directement comparables à ceux d’une cellule entière — raison pour laquelle les évaluations comparent systématiquement les deux chaînes [2].
Frais, cryoconservé ou fixé
Le traitement à frais reste la référence lorsqu’il est possible, mais il impose une contrainte logistique lourde. La cryoconservation autorise le stockage, au prix d’une perte sélective — critique pour les granulocytes, qui ne la supportent pas.
C’est là que le champ s’est déplacé récemment. Les méthodes fondées sur la fixation visent à préserver l’intégrité des ARN après prélèvement, et une évaluation multisite a montré qu’elles retiennent mieux les populations granulocytaires fragiles que le traitement à frais [7]. Cette même étude offre une illustration du principe exposé plus haut : pour disposer d’une référence indépendante, les auteurs ont caractérisé leurs cellules par un panel de cytométrie à vingt-et-une couleurs — une modalité qui ne partage pas les étapes qu’ils cherchaient à évaluer. Et la conséquence dépasse la paillasse : puisqu’un échantillon fixé se conserve et se transporte, la collecte distribuée et le traitement centralisé deviennent possibles. Une population qui ne survit ni au transport ni à la congélation rendait une étude multicentrique impraticable ; la fixation lève cet obstacle. Le choix du mode de conservation est donc une décision de conception de projet autant qu’un choix technique.
Viabilité, doublets, ARN ambiant
Trois indicateurs se surveillent en routine, et chacun trahit un défaut de préparation. Une viabilité dégradée signale une dissociation trop agressive et libère de l’ARN dans le milieu. Cet ARN ambiant est ensuite capturé indistinctement et attribué à des cellules qui ne l’exprimaient pas. Les doublets, enfin, résultent d’une suspension trop concentrée ou mal dissociée ; une comparaison de méthodes en rapporte jusqu’à environ 20 % sur l’une des chimies évaluées [6].
Ce qui ne se rattrape pas à l’analyse
L’analyse dispose d’outils réels. On estime et l’on soustrait l’ARN ambiant, on détecte et l’on retire les doublets, on filtre les cellules à faible complexité. Ces corrections sont utiles et il serait absurde de s’en priver.
Elles ont cependant deux limites qu’il faut connaître avant de prélever.
La première est qu’on ne reconstitue pas une population absente. Si les granulocytes n’ont pas survécu, aucun traitement statistique ne les fera apparaître, et rien dans les données de séquençage seules ne signalera leur manque : l’absence ne se déclare pas. Elle se détecte en revanche par comparaison externe — c’est précisément en confrontant leurs jeux de données à la cytométrie, qui donnait 10 à 20 % de neutrophiles, que les auteurs de l’atlas pulmonaire ont établi la sous-représentation. Mesurer la composition par une seconde modalité est donc la parade la plus simple.
La seconde est plus subtile. Les seuils de filtrage sont calibrés sur des cellules à contenu en ARN normal. Sur un échantillon riche en granulocytes, la courbe de coude , qui sépare habituellement sans ambiguïté les cellules réelles des gouttelettes vides, cesse de présenter une séparation nette, précisément parce que ces cellules expriment peu. Cette comparaison de méthodes a dû abaisser le seuil à cinquante gènes et cinquante identifiants moléculaires uniques pour ne pas les exclure [6], ce qui revient à admettre du bruit pour ne pas perdre le signal. Aucun réglage ne supprime ce dilemme : il se règle en amont, par le mode de préparation.
Il existe enfin une réponse qui ne consiste pas à mieux dissocier mais à ne pas dissoudre le tissu. La transcriptomique spatiale, que nous traitons ailleurs, mesure l’expression sur la coupe elle-même et échappe donc par construction à l’artefact de dissociation , au prix d’une résolution qui, selon la technique employée, va de plusieurs cellules par position à l’échelle du micromètre.
Avant de prélever
Six questions, dans cet ordre, évitent la plupart des déconvenues.
Quelles populations veut-on voir, et laquelle porte l’hypothèse ? Ces populations sont-elles réputées fragiles ou pauvres en ARN ? La logistique permet-elle un traitement immédiat, ou faut-il conserver , et si oui, la population visée supporte-t-elle la congélation ? Le protocole de dissociation est-il adapté au tissu, et sa durée réduite au nécessaire ? Le dispositif comporte-t-il de quoi distinguer un artefact de préparation d’un signal biologique ? Et les seuils d’analyse ont-ils été fixés en connaissance des populations attendues, plutôt que par défaut ?
Comment Inovarion peut vous accompagner
Inovarion prend en charge la chaîne complète en amont du séquençage : conception du protocole de préparation selon les populations visées et les contraintes logistiques du projet, dissociation tissulaire, tri cellulaire, contrôles de viabilité et de qualité, puis analyse bio-informatique — détection des doublets, correction de l’ARN ambiant, calibration des seuils en fonction des populations attendues. Nos équipes ont mené ce travail sur des populations réputées difficiles, du granulocyte immature au lymphocyte B mémoire d’une extrême rareté, ce qui suppose de traiter la préparation comme une partie de l’expérience et non comme sa formalité préalable.
Publications
Références du domaine
- van den Brink SC, Sage F, Vértesy Á, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods, 2017;14(10):935-936. PubMed
- Denisenko E, et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology, 2020;21(1):130. DOI
- Adam M, Potter AS, Potter SS. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development, 2017;144(19):3625-3632. PubMed
- O’Flanagan CH, Campbell KR, Zhang AW, et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology, 2019;20(1):210. DOI
- Salcher S, Sturm G, Horvath L, et al. High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer. Cancer Cell, 2022;40(12):1503-1520.e8. PubMed
- Hatje K, Schneider K, Danilin S, et al. Comparison of single-cell RNA-seq methods to enable transcriptome profiling of neutrophils in clinical samples. Cell Reports Methods, 2025;5(9):101173. PubMed
- Kolling FW IV, Podnar JW, Wilkins O, et al. Multisite assessment of methods for cell preservation upstream of single-cell RNA sequencing. Journal of Biomolecular Techniques, 2026;37(2):9-27. DOI
Contributions Inovarion
- Deschamps P, Wacheux M, Gosseye A, et al. CXCL8 secreted by immature granulocytes inhibits WT hematopoiesis in chronic myelomonocytic leukemia. The Journal of Clinical Investigation, 2024;134(22):e180738. DOI
- Chappert P, Huetz F, Espinasse MA, et al. Human anti-smallpox long-lived memory B cells are defined by dynamic interactions in the splenic niche and long-lasting germinal center imprinting. Immunity, 2022;55(10):1872-1890.e9. PubMed
à jour en juillet 2026